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還在為如何提取完整的外泌體發(fā)愁嗎？
更新時(shí)間：2022-04-14 瀏覽次數(shù)：2405
在過去的幾十年中，外泌體因其在改變細(xì)胞功能中的作用而受到了廣泛關(guān)注。外泌體是膜結(jié)合的納米級(jí)囊泡，最初通過晚期核內(nèi)體的內(nèi)陷形成為特定的腔內(nèi)囊泡群。由于晚期多泡內(nèi)體與質(zhì)膜融合，這些內(nèi)體來(lái)源的腔內(nèi)囊泡隨后被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，這是一種將它們與其他類型的細(xì)胞外囊泡區(qū)分開來(lái)的生物發(fā)生機(jī)制[1]。
因此，外泌體外膜由富含供體細(xì)胞膜衍生蛋白的磷脂雙層和繼承細(xì)胞質(zhì)生物分子（包括蛋白質(zhì)、酶、mRNA、miRNA 和代謝物）的水內(nèi)核組成。外泌體的大小在 20-120 nm 之間，并且在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上因親代細(xì)胞而異[2]。外泌體亞群呈現(xiàn)出不同的形狀，從球形到絲狀和細(xì)長(zhǎng)形，還可以包括不同的子隔室[3]。
外泌體結(jié)構(gòu)及形成過程
目前，已經(jīng)開發(fā)了多種分離策略來(lái)從各種生物來(lái)源中離外泌體，這些生物來(lái)源包括牛奶、血液和尿液，以及植物衍生產(chǎn)品，例如水果和蔬菜。
外泌體利用多種內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。有趣的是，外泌體還可以克服物種障礙，在不同來(lái)源的細(xì)胞之間傳遞生物分子[4]。外泌體介導(dǎo)生物功能，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)重要的生理和病理過程[5]
外泌體生物學(xué)功能
由于外泌體是內(nèi)源性具有生物活性的生物分子的天然載體，它們已被廣泛用于主動(dòng)和被動(dòng)傳遞合成生物分子。它們的內(nèi)源性和納米特性也使這些納米載體能夠跨越生物屏障，并賦予它們優(yōu)良的生物相容性[6]。
因此，這幾年各領(lǐng)域廣泛展開外泌體相關(guān)的研究，外泌體研究橫跨幾乎所有的研究領(lǐng)域（免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)等）。
然而，目前用于外泌體研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)仍處于開發(fā)階段，許多問題仍有待改進(jìn)。例如，外泌體純化方法中，超速離心法和聚合物沉淀法（市售試劑盒）提取的外泌體中混有多種雜質(zhì)，會(huì)給后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成許多障礙。而抗體親和法和密度梯度離心法這兩種提取方法的問題在于，雖然可以提取到高純度的外泌體，但外泌體結(jié)構(gòu)不完整，無(wú)法用于分析外泌體的生理功能。
磷脂酰絲氨酸和Tim4新型外泌體提取法
外泌體膜雖然含有分泌細(xì)胞源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，但目前普遍認(rèn)為在活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸（PS）通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶作用定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)[7]。
作為通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的吞噬受體（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4，Tim4）蛋白通過細(xì)胞外域IgV域與結(jié)合了鈣離子的PS結(jié)合[8]。
利用這一原理，Wako和金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)系免疫學(xué)華山教授共同開發(fā)一款劃時(shí)代的外泌體提取方法，利用Tim4固化磁珠，在鈣離子存在下捕捉培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體，再添加螯合劑從而提取外泌體[9]。并且MagCapture™外泌體提取試劑盒PS實(shí)現(xiàn)了比傳統(tǒng)的外泌體純化法更加簡(jiǎn)單地提取高純度完整狀態(tài)的外泌體。
這是迄今為止取代黃金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法的新型外泌體純化法。
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS
巨噬細(xì)胞表面的Tim4蛋白特異性結(jié)合細(xì)胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS）。
利用Tim4固化磁珠，在Ca2+ 存在條件下捕捉培養(yǎng)上清或血清等樣本中的外泌體，通過使用含有EDTA的洗脫液洗脫，可獲得高純度的完整細(xì)胞外囊泡（EVs）。
01
原理
02
特點(diǎn)
● 可獲得高純度完整細(xì)胞外囊泡，可用于蛋白及核酸分析、共培養(yǎng)及體內(nèi)注射
● 回收率高
● 操作簡(jiǎn)便（3.5h），不需超速離心
03
應(yīng)用實(shí)例
外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析
通過MASS鑒定結(jié)果比較豐度最高的前 shi 種蛋白。
樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（含10%去外泌體FBS）
白色柱：源自外囊泡的人類蛋白
灰色柱：來(lái)自FBS的牛蛋白污染物
綠色：來(lái)自外囊泡的標(biāo)記蛋白
[9] Nakai Wataru.et al. (2016). A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep, 6, 33935.